因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時，ELISA試劑盒應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2，圖1-4)，人ELISA試劑盒如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect)，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。

    假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，人ELISA試劑盒雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。

    由于一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與人ELISA試劑盒法可分為酶標記親和素-生物素(LAB)法和橋聯親和素-生物素(ABC)法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體(或抗原)代替原ELISA系統中。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA試劑盒中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在人ELISA試劑盒應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通人ELISA試劑盒多用了兩種試劑，增加了操，在臨床檢驗中ABS-ELISA試劑盒應用不多。